研究背景：
糖尿病视网膜病变(DR)是一种广泛存在的威胁视力的疾病，它是是糖尿病潜在的致盲并发症，也是导致全球视力损害的重要原因。“神经血管单位损伤”的概念支持了检测神经视网膜功能障碍的重要性，该概念的特征是神经细胞、胶质细胞和血管细胞在DR早期阶段相互影响，从而导致亚临床改变。有报道发现，高糖能够诱导血管内皮细胞产生活性氧(ROS)，然后ROS促进Muller胶质细胞和神经细胞死亡，通过这些实验引入了高糖-活性氧-神经细胞损伤的概念。
有报道表明在大脑中，omega-3脂肪酸在神经退行性疾病中起到保护作用，例如阿尔茨海默病和帕金森病。而视网膜与大脑相似，有富含脂肪酸的光感受器，是神经细胞、胶质细胞和血管细胞的复合体。因此，作者通过将类似的“神经血管单位损害”概念应用于早期DR的脑损害和神经视网膜功能障碍，为DR神经变性的治疗探索新的途径。
脑源性神经营养因子(BDNF)已被发现可以预防DR诱导的神经视网膜损伤，但BDNF在DR中是如何上调的暂不清楚。据报道，BDNF可以通过与无长突细胞和视网膜神经节细胞表达的TrkB受体结合，激活ERK和PI3激酶通路，来表达神经保护作用。并且最近有报道发现口服omega-3脂肪酸(主要是二十二碳六烯酸和EPA)可以逆转肥胖大鼠下丘脑中BDNF表达的下调。作者前期实验的结果也表明了口服二十碳五烯酸乙酯(EPA-E)可以在DR早期增加18-HEPE来阻止Muller胶质细胞的视网膜神经变性。在以上研究报道的基础上，作者推测视网膜血管内皮细胞暴露ROS可引起Muller胶质细胞BDNF表达下调，进而导致包括无长突细胞在内的神经视网膜细胞继发性损害，由此猜测DR早期OPs减少所致的神经视网膜功能障碍可能是由视网膜血管内皮细胞ROS暴露引起的Muller胶质细胞BDNF表达下调所致。
结果：
Result1：ROS降低Muller胶质细胞和视网膜神经细胞的生物活性以及BDNF对活性氧损伤的保护作用
DR患者眼内8-OHdG和H2O2水平明显高于黄斑裂孔和视网膜膜患者眼内8-OHdG和H2O2水平(图1A，B)。在确认DR中存在ROS后，作者验证了高糖对HREC和MIO-M1的影响。在含有VEGF的25mM葡萄糖中，HRECs的细胞外H2O2水平明显高于在5.6mM葡萄糖中加入VEGF的HRECs的H2O2浓度(图1C)。相反，与5.6mM的葡萄糖相比，25mM的葡萄糖并没有增加MIO-M1细胞外H2O2的浓度，但在暴露72小时后显著提高了MIO-M1的细胞活力(图1D，E)。根据这些发现和以往的研究表明，高血糖本身直接导致神经视网膜损伤，并且作者推测高糖条件下HREC产生的ROS是糖尿病神经视网膜损伤的另一个诱发因素。因此，作者以氧化应激为重点，给所有细胞在72小时内提供含25mM葡萄糖的培养基，并诱导氧化应激以模拟早期DR的状态。在MIO-M1细胞中，H2O2显著降低了细胞活力和BDNFmRNA水平，且与对照组相比，培养液中BDNF蛋白水平显著降低(图1F-H)。同样，H2O2以剂量依赖的方式显著降低PC12D细胞的活力(图1I)。并且，BDNF的改善了H2O2处理的PC12D细胞活力的下降，并呈剂量依赖关系，以及改善了PC12D细胞中每细胞体轴突长度从一开始的相对变化率随时间的下降(图1J，K)。
Result2:EPA对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜功能的保护作用
为了评价EPA对DR的神经保护作用，作者使用全场视网膜电图(FullFieldERG)进行评价。首先检查了注射STZ后ERG的振荡电位(OPs)何时发生显著变化，并确认它发生的时间是在与对照组相比的4周后(图2B)。此后，作者评价了口服EPA-E8周对视网膜电图的影响。STZ组ERG的b/a波比值明显低于对照组，而与EPA组相比无显著性差异(图2C)。STZ组ERG的OPs明显低于对照组，而EPA组的OPs明显高于STZ组(图2D)。综上所述，STZ组b/a波比值和OPs的降低提示DR的神经视网膜功能下降，而EPA组的OPs显著升高表明口服EPA-E改善了DR的神经视网膜功能下降。免疫组化结果显示谷氨酰胺合成酶和BDNF共同定位于视网膜内侧(图2F)，表明BDNF是由Muller细胞、神经节细胞和星形胶质细胞产生的。并且，8-OHdG在STZ组与对照组相比显著增加，在EPA组显著降低，表明EPA-E抑制了氧化应激的发生(图2G)。而STZ组大鼠视网膜BDNFmRNA水平和相对BDNF蛋白水平明显低于对照组和EPA组(图2H，I)。这些结果提示，在DR早期口服EPA-E可减少ROS，改善BDNF的减少，从而恢复视网膜细胞的损伤。
Result3：18-HEPE改善BDNF表达及神经视网膜功能
为了进一步探讨EPA在DR中的保护机制，作者检测了大鼠视网膜组织中的脂质介质。EPA组大鼠视网膜中18-HEPE、15-HEPE、12-HEPE和5-HEPE水平明显高于对照组和STZ组，而EPA组大鼠视网膜12-HETE和11-HETE值明显低于对照组和STZ组（图3）。与对照组相比，经H2O2处理的MIO-M1细胞的相对BDNFmRNA水平和BDNF蛋白水平在2μM18-HEPE组明显升高，而在0.5μM18-HEPE组则无明显变化(图4A，B)。相反，与对照组相比，2μM15-HEPE、2μM12-HEPE和2μM5-HEPE对BDNFmRNA的相对表达量没有显著增加(图4C)。同时，2μM15-HETE组和2μM12-HETE组MIO-M1细胞的BDNFmRNA相对水平均显著低于对照组(图4D)。此外，H2O2显著降低所有PC12D、HREC和hRPE细胞的存活率，但18-HEPE不抑制这些减少(图4E-G)。这些结果证实了18-HEPE在Muller胶质细胞BDNF增加中的作用最为显著，而对其他类型的眼细胞无明显影响。此外，玻璃体内注射18-HEPE的STZ大鼠视网膜OPs和BDNFmRNA水平明显高于PBS组(图4J，K)。这些数据说明了18-HEPE特异性诱导了STZ大鼠视网膜BDNF的表达，并导致了ERG中OPs的恢复。
总结：
已经报道发现口服omega-3脂肪酸，包括EPA，在DR中具有抗炎、抗血管生成和抗氧化作用。然而，很少有研究报道EPA的神经保护作用。本实验首次证明了EPA具有明显的神经保护作用，它可以通过增强Muller胶质细胞中BDNF的表达来改善DR的ERG中的OPs。并且在给予EPA-E的大鼠视网膜中产生了包括18-HEPE在内的一些EPA代谢产物，而18-HEPE能特异性地诱导了Muller胶质细胞中BDNF的表达。然而，omega-3脂肪酸(包括其代谢物)的确切作用机制尚不清楚，且18-HEPE的特异性受体尚未确定，这还需要深入研究。
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